文｜觀察未來科技

近日，Nature 公布了 2023 年值得關注的 7 項技術，分別是：單分子蛋白質測序、詹姆斯韋伯太空望遠鏡、體積電子顯微鏡、CRISPR、高精度放射性碳測、單細胞代謝組學，以及體外胚胎模型。5項技術花落生物醫學，其中，單分子蛋白質測序更是受到廣泛關注。

雖然一直以來，都是基因測序更為人所知，但今天，蛋白質測序越來越展現其對認識生物過程的獨特價值。不管是基因測序，還是蛋白質測序，生物測序都已經進入快車道，并為藥物研發和疾病治療帶來了新的思路。

從基因測序到蛋白質測序

基因測序的出現極大地推動了生物學的發展，徹底改變了生物學的研究。今天，它已經成為分子生物學研究中最常用的技術。在許多不同的細胞環境中對DNA和RNA進行排序可以發現關于遺傳病、生物發育和細胞譜系追蹤等的潛在原因。從人類基因組計劃，到人類基因組單倍型圖計劃，再到人類癌癥基因組及個體基因組計劃，第一代和第二代測序技術功不可沒。

而近幾年發展起來的第二代基因測序技術更使得基因測序進入了高通量、低成本的時代。目前，基于單分子讀取技術的第三代基因測序技術已經出現，該技術測定基因序列更快，并有望進一步降低測序成本，為人類從基因水平深入理解疾病的發生、發展、診斷和治療提供新的手段，并使個體化精準醫療成為現實。

要知道，相比于基因測序，蛋白質測序甚至更早出現，并具有相同重要的價值和意義。不管是蛋白質測序，還是基因測序，都離不開一個人，那就是弗雷德里克·桑格。1918年8月13日，桑格出生于英國格洛斯特郡，父親是一名內科醫師，曾作為傳教士在中國短暫工作，后因健康原因返回英國，母親則是從事棉花加工生意的商人后代。桑格原本打算跟隨父親的步伐邁入醫學界，但高中畢業進入劍橋大學學習后，轉而對生物化學產生了濃厚興趣，決定成為一名科學家。而當時的劍橋，正好擁有諸多生物化學先驅。

1944年，桑格在劍橋取得化學專業的博士學位，留校跟隨正在研究胰島素的生物化學系新任教授阿爾伯特·查爾斯·奇布諾爾開始了博士后研究，專注于為氨基酸排序的工作。胰島素在人體的糖代謝過程中起到重要作用，如果胰島素分泌不足，就有可能導致糖尿病。科學家開始關注胰島素的生化性質，不僅僅因為它具有醫學的應用前景，還因為它是當時僅有的幾種能夠被提純的蛋白質。

在桑格涉足胰島素研究之時，世界生物學界對于蛋白質的認知存在較大分歧，一種觀點認為，蛋白質沒有明確的化學組成和結構；而另一派則堅持認為蛋白質具有結構，并且可以通過化學方法測定氨基酸的排列順序。

桑格發現了一種方法，可以截斷連接氨基酸鏈的“橋”，這使得他可以研究單個的氨基酸片段，然后他又將這些片段重新組合成氨基酸長鏈，進而推導出完整的胰島素結構。1953年，桑格成功地測序了胰島素的氨基酸序列，推翻了原本蛋白質是無序高分子的推論，這項研究極大推進了生命科學的發展，并給桑格帶來了1958年的諾貝爾化學獎。

獲得1958年的諾貝爾化學獎之后，來自世界各地的訪學和學術報告邀請紛至沓來，不過很快，桑格又投入了基因測序的研究之中。

蛋白質測序的困局？

如果說基因檢測方面的技術進步幫助我們快速而全面地了解了人類健康相關的成千上萬個基因，那么蛋白質測序就以同樣的方式揭開了成千上萬種蛋白質的奧秘。在癌癥、阿爾茨海默癥、心力衰竭和糖尿病等許多疾病中，細胞產生的蛋白質等物質可以充當類似于指紋的獨特的生物標志物，更好地檢測這些生物標志物能夠幫助研究人員了解疾病成因，也能為患者提供更早、更準確的診斷。

蛋白質測序除了可以更好地檢測疾病的生物標志物，還可能提供一種全新的方式研究癌癥等問題。比如，研究人員可以逐個觀察細胞，以了解腫瘤如何從一小群相同的細胞演變成一群遺傳分化的、各具優劣勢的細胞。這些研究將為開發治療癌癥的新方法提供思路。

雖然今天基因測序方法的增長速度很快，但蛋白質的測序方法，卻在很大程度上落后了。目前的蛋白質測序方法主要分為三類：基于PCR擴增的蛋白質測序、Edman降解測序以及基于質譜的蛋白質測序。

基于PCR擴增的蛋白質測序是利用細胞中表達的DNA或者RNA進行基因測序，然后再按照氨基酸密碼子表轉換為蛋白質的氨基酸序列，本質上屬于基因測序技術。Edman降解測序是較早發展的蛋白質測序技術，利用化學方法從蛋白質的N端將氨基酸依次降解，再使用高效液相色譜對氨基酸進行鑒定。但是這種方法只能用于鑒定蛋白質和多肽的N-末端氨基酸殘基，無法對大的蛋白質進行全序列測定。此外，Edman降解法也有一定的局限，例如N末端封閉或有化學修飾的情況下將不能使用Edman降解法對蛋白質序列進行分析。目前使用最廣的蛋白質測序方法是質譜法，較Edman降解法而言，其優點在于，質譜法更敏感，可以更快地裂解肽，可以識別末端封閉或修飾的蛋白質。

換言之，盡管蛋白質作為中心法則上的最后一環，科學家們可以在一定程度上通過基因序列推斷對應的蛋白質序列，結合現有的Edman降解或質譜等方法獲得部分肽段序列信息，就可以在一定程度上實現蛋白質測序。但是這些方法在針對蛋白質的翻譯后修飾檢測、蛋白質序列變化監測和低豐度蛋白質富集等方面仍然存在局限。這就要求蛋白質測序的發展方向一定是對蛋白質的從頭測序，且盡量能夠實現單細胞水平的蛋白質輸入。

蛋白質測序路向何方？

為了改善當前蛋白質測序的局限，2018 年，德克薩斯大學奧斯汀分校的生物化學家 Edward Marcotte 開發了一種稱為單分子熒光測序的方法。在此過程中，用不同的熒光標記蛋白質，可以對單個樣本中的數百萬個蛋白分子進行測序。“我們基本上創造了一種類似 DNA 測序的技術來研究蛋白質（序列）。”

熒光測序也是最早開發的高通量單分子蛋白質測序方法之一，它將熒光肽的單分子顯微鏡與Pehr Edman的降解化學相結合，使許多單獨的肽分子能夠在測序流動池中被平行監測，因為它們的N端氨基酸以循環方式被移除。

可以說，熒光測序是自下而上的蛋白質組學方法的一個例子，利用已知的蛋白質組或基因組序列，確定單個蛋白水解肽或蛋白質片段的部分序列，然后將其與用于蛋白質鑒定的參考數據庫相匹配。

人們已經證明了不需要對蛋白質上的每個氨基酸進行從頭鑒定，而是鑒定幾個氨基酸的序列位置就足以從參考蛋白質組中鑒定出蛋白質。在實踐中，熒光測序是一種混合方法，識別標記氨基酸從頭開始的序列位置，然后將這些部分序列與參考數據庫進行匹配，以識別蛋白質。

除此之外，其他研究人員還在開發模擬基于納米孔的 DNA 測序的技術，根據多肽通過微小通道時在電流中引起的變化來分析多肽。如荷蘭代爾夫特理工大學的生物物理學家 Cees Dekker 和他的同事使用由蛋白質制成的納米孔，并且能夠區分通過孔的多肽中的單個氨基酸；以色列理工學院生物醫學工程師 Amit Meller 的團隊正在研究由硅基材料制成的固態納米孔裝置，這些裝置可以同時對許多單個蛋白質分子進行高通量分析。

2022年，美國Quantum-Si公司Brian D. Reed研究組還提出了一個單分子蛋白質測序的方法以及集成系統可以對蛋白質組學進行研究。其中，為了實現單分子蛋白質的測序，研究人你有們使用互補金屬氧化物半導體制造技術構建了具有納秒精度的定制時域敏感半導體芯片，包含用于單分子檢測的完整集成組件，其中包括光傳感器、光波導電路和用于生物分子固定化的反應室。

目前，雖然單分子蛋白質測序仍然只是概念驗證，但商業化正在快速到來。2022 年，Quantum-Si 公司成為商業化首個下一代單分子蛋白測序平臺的公司，它使用熒光標記的結合蛋白來識別蛋白質末端的特定氨基酸或多肽序列。該公司已宣布計劃在今年推出第一代儀器。

總的來說，蛋白質測序為生物過程提供了深刻的見解。然而，想要了解細胞中蛋白質組的復雜性以及動態變化、在疾病狀態下的變化，并將這種技術變成一個易獲取、低造價的方法并不容易，即便如此，蛋白質測序依然非常重要性，這也是Nature會將蛋白質測序認為是2023年值得關注的7項技術之一的原因。