文｜動脈新醫藥
近幾年，細胞與基因治療因其驚人的療效，被大眾寄予厚望。同樣，細胞與基因治療背后的核心底層技術——基因編輯工具，也在近年開始浮出水面，被越來越多的企業和資本重視。
2022年2月28日，美國專利和商標局（USPTO）裁定，張鋒所在的博德研究所團隊繼續擁有在真核細胞中使用CRISPR基因編輯工具的專利。“諾獎（以Jennifer和Emmanuelle為代表的團隊）團隊”又一次輸掉了這場長達近10年的知識產權爭奪。針對上述結果，Jennifer團隊表示將會提起上訴，看來這場長達10年的專利角逐還遠未結束。
作為醫療行業觀察者，動脈新醫藥也在時刻關注基于CRISPR技術的新一代基因編輯工具。對此，我們采訪了國內數家基因編輯工具開發/細胞與基因治療企業，聽聽業內科學家們的看法。接下來，你將了解到：
1.作為目前使用最廣泛的基因編輯工具，CRISPR/Cas9是否存在技術短板？
2.基于CRISPR/Cas9的優化，是否為錦上添花？一旦出現專利壟斷，此前的努力會功虧一簣嗎？
3.針對基因編輯工具技術，國內團隊偏向于技術優化還是底層技術的創新？
4.針對近幾年較熱的CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13，它們的專利布局如何？國內企業為何可以在短期內就做出創新性成果？
5.為何大部分企業針對基因編輯工具的開發和優化都十分“低調”，從不宣傳？投資機構更看重產品進展還是底層技術？
6.未來，基因編輯工具會朝著哪些趨勢開發和優化？國內和國外還存在多少差距？
01 脫靶、安全、編輯效率，都不是痛點
根據公開資料，我們可以很輕易的歸納出CRISPR/Cas9基因編輯工具本身存在以下幾個痛點：
1、潛在的脫靶風險（脫靶的檢測與控制）。對于潛在的脫靶風險的控制，科研團隊在設計基因編輯工具時，可盡量避免有相似的序列，以免造成序列依賴性。基于此進行嚴格的脫靶驗證，就可最大程度避免該風險。
2、切割基因組DNA序列所導致的潛在安全性風險。在此過程中，如果發生了DNA雙鏈斷裂，可能會引起DNA大片段的缺失，或染色體結構的變化。但通常情況下，大片段的缺失和染色體的異常變化都會導致細胞不容易存活。目前，尚未報道過相關的安全事件，所以這一問題暫時還沒有影響基因編輯在產業端的應用推進。
3、對PAM序列的要求，限制了其在基因組上的可編輯范圍。在CRISPR/Cas9靶向DNA進行編輯時，可以實現DNA雙鏈的斷裂。在此基礎上，如果再加上相關的轉錄因子，則可以實現某些基因的轉錄調控。但這些基因的靶向位點會受到PAM序列的限制，從而不能讓基因編輯實現“指哪打哪”的魔力。
4、體內遞送系統的設計和搭配。CRISPR/Cas9作為一個基因編輯工具，如何跟體內的遞送系統進行有效的搭配，同時保持本身的編輯能力和成藥能力，也是一個需要不斷被優化的點。目前CRISPR/Cas9分子量較大，在進行體內基因治療需要AAV進行遞送時，AAV裝載量的限制，就要求基因編輯工具的尺寸進一步微型化。
總體來說，不僅是CRISPR/Cas9，所有的CRISPR/Cas蛋白家族或多或少都有自己的優點和不足。沒有任何一個CRISPR/Cas基因編輯工具可以完全覆蓋所有的應用場景，如果將CRISPR/Cas9用于敲除某個基因，它已經足夠優秀。只要能夠做到“術業有專攻”，將基因編輯工具用于合適的領域，便可以讓其“發光發熱”。
02 錦上添花or功虧一簣？
國內團隊基于專利技術被國外壟斷的CRISPR/Cas9基因編輯工具的優化，是否為錦上添花？一旦出現專利壟斷，此前的努力會功虧一簣嗎？
在討論這個問題前，我們需要縷清CRISPR/Cas9的發展之路，和伴隨發展延續至今的專利之爭。
2012年8月，Jennifer團隊在《Science》合作發表了CRISPR/Cas9領域的里程碑論文；2013年2月，張鋒團隊也在《Science》發表了論文，文章原始數據表明其相關實驗早于Jennifer團隊。2014年，美國專利商標局率先批準了張鋒團隊所在的博德研究所的專利請求。在此后多次訴訟中，因Jennifer團隊證據不足，張鋒團隊屢占上風，特別是最具商業價值的、用于哺乳動物的基因編輯工具專利被張鋒團隊牢牢攥在手中。
2020年10月，諾貝爾評獎委員會公布化學獎獲獎名單，Jennifer和Emmanuelle獲得殊榮，原因是她們開發了基因編輯工具CRISPR/Cas9。張鋒“痛失諾獎”，引發熱議。今年2月28日，美國專利和商標局裁定，張鋒所在的博德研究所團隊擁有在真核細胞中使用CRISPR基因編輯工具的專利。“諾獎”團隊暫時輸掉了此次對于知識產權的爭奪，但這場超過10年的專利角逐還遠未結束。
對于CRISPR/Cas9的專利屬權一直爭議不斷，但很明確的是，CRISPR/Cas9的專利技術基本屬于國外。
“任何一種技術，在發展早期都具有待突破的瓶頸。對于技術發明人，他們也需要解決這些瓶頸，才能真正的實現技術在產業化端的成功應用。如果國內的團隊基于CRISPR/Cas9技術的優化足夠重大，以至于國外團隊也需要用到我們的‘錦上添花’，就有可能通過專利交叉許可解決技術的專利壟斷問題。”邦耀生物聯合創始人兼副總裁李大力博士告訴動脈新醫藥。
“一般企業在立項時就會考慮關鍵技術的IP屬性這一問題。我們可以看到，CRISPR/Cas9專利權人在全球范圍內都向很多企業提供了商業化授權許可，包括技術服務和藥物開發等各個方向。企業需要向專利持有方支付授權費或達成授權許可協議，便可以應用相關技術。另一方面，CRISPR/Cas9技術也在持續創新和改進，衍生的這些技術也能產生巨大的商業價值。”瑞風生物創始人梁峻彬博士告訴動脈新醫藥。
關于轉讓或許可技術給其他公司進行開發，從而帶來收益，相關的例子并不缺乏。例如日本微生物組基因編輯療法公司Bio Palette從神戶大學獲得了使用nickase Cas9進行單堿基編輯的專利的許可，做了一系列創新并獲得了收益，這一技術就屬于對CRISPR/Cas9技術的優化。再例如Bio Palette與Beam公司就堿基編輯技術進行了交叉許可（獲得Beam許可），Bio Palette因此從中獲益。
“在工業界，美國的基因編輯企業在成立之初就會優先考慮其底層IP是否清晰。對于國內的早期企業而言，依靠團隊或平臺優勢就能夠獲得資本和市場的認可。隨著企業的發展，基于技術優化的一定積累，開發原始創新的技術更有利于促進企業長遠和自由發展。”輝大基因創始人兼CEO姚璇博士告訴動脈新醫藥。
基于業內人士的認知，我們不妨看得更“開”。如果一項技術確實具有重大的價值，那它其實很難被個別機構所壟斷。這種壟斷只會埋沒高技術的價值，不利于其科研和商業價值的放大。不管在學術界還是產業界，都需要大量的持續創新才會使得這個技術的本身的社會價值和商業價值越來越大。
03 技術優化or底層創新？
盡管國內大多企業認為基于CRISPR/Cas9的技術優化并不會出現功虧一簣的情況。但是當動脈新醫藥問及企業目前偏向于基于國外專利技術進行優化還是自主研發實現底層創新時。企業們還是“口嫌體正直”的統一選擇了更為艱難的底層創新。
李大力博士說道：“邦耀生物做了許多堿基剪輯器的開發，并在2020年就開發了一系列超高活性的新型胞嘧啶堿基編輯器（命名為：hyCBE），相關成果已在線發表于Nature Cell Biology。至今，它仍然是活性最高的胞嘧啶堿基編輯器（最高可提升20倍活性），其編輯窗口較傳統編輯器也有明顯擴增，能編輯到更多的位點。更重要的是，這種改造方法具有兼容性，它不僅適用于改造胞嘧啶堿基編輯器，其他堿基編輯器同樣適用于這個方法，在基因治療等領域已展示出非常廣闊的應用前景。
同年6月，邦耀生物團隊又在國際著名學術期刊Nature Biotechnology發文，開發出全新的雙堿基編輯系統，這項成果不僅是堿基編輯工具開發領域的又一重大突破，也為基礎研究和遺傳性疾病如β-地中海貧血的治療提供了新的發展方向和工具。針對上述提到的堿基編輯器，邦耀生物已申請了多項專利，并進行了全球化布局。”
梁峻彬博士說道：“瑞風目前針對CRISPR/Cas系列工具酶進行了開發。在Cas13方面我們率先進行了專利布局。瑞風開發的新型蛋白對特定RNA靶核酸的編輯活性優于目前最常用的高活性CasRx，且脫靶效應更低。其中一高活性Cas13的尺寸比CasRx小約70aa，更有利于AAV遞送，在成藥上具有極大的優越性。此外，新的Cas12亞型也是瑞風正在開發的方向。我們還對某些Cas12蛋白進行了工程化改造，目前也已經取得了不錯的成果，顯著提高了野生型參比蛋白的活性，且不受Cas12亞型專利壁壘限制。”
姚璇博士說道：“輝大科學家團隊在2020年通過數據計算分析開發了兩類新型CRISPR/Cas13 RNA編輯系統，2021年在《Nature Methods》發表了相關文章，介紹了我們如何在不同的數據庫中篩選蛋白，進而獲得高的RNA編輯器。這兩年間，我們對Cas13進行了許多改造和優化，得到了特異性強、脫靶性低的高保真版本hf-Cas13蛋白，在動物實驗中已經取得了積極的有效性和安全性試驗數據。Cas12Max是輝大子品牌HuiEdit科學家團隊在去年開發的新型DNA編輯器，目前經過優化后的Cas12蛋白在體外和體內都能實現與spCas9相當的DNA編輯效率。同時，團隊還在繼續優化其PAM識別區，以進一步擴大Cas12的靶向序列范圍。針對CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13，輝大均已申請相應的全球專利，并做了底層專利的布局。基于這些成果，輝大正在積極和國內外多家企業洽談專利許可、聯合開發等相關合作。”
為何國內的基因編輯企業們會在近幾年頻頻爆出底層技術的創新？究其原因，主要有三。
其一，在CRISPR/Cas9基因編輯工具技術剛剛面世時，不管是企業還是科研機構，都還處于了解和學習的歷程。那時候國內的團隊們本身對新工具的認知還處于不斷深化和積累的狀態，只能對底層技術進行優化。這一階段對應國內的2013年至2018年，屬于CRISPR/Cas9基因編輯工具技術在國內發展的第一個五年。
其二，在積累到足夠經驗時，國內的團隊基于此前優化的創新點得出通用的底層邏輯，或者是開發基因編輯工具的相關經驗。通過技術遷移或者是技術兼容，初步探索新型基因編輯工具。該階段對應國內的2018年至今。
其三，縱觀整個基因編輯工具的發展歷史，我們可以發現人類對于自然界微生物的了解還是冰山一角。仍然有大量的編輯工具可以持續不斷的發掘。沿著高度優化或原創性技術開發的方向前進，就能一直對現有基因編輯工具進行局部創新和迭代創新。
關于基因編輯工具的底層創新，其實國內企業早就有所布局。近幾年，關于CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13基因編輯技術的相關成果頻頻爆出。在眾多的家族蛋白中，為何會是CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13率先“出圈”？其實這并沒有什么特定的原因。
這主要由于，相比于CRISPR/Cas9“密不透風”的專利保護范圍，CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13具有巨大的專利布局空間。
從基因編輯工具本身來講，CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13與CRISPR/Cas9都使用了Cas家族蛋白，相關工具也都具有簡便、高效的優點（相比于ZFN、TALEN技術）。一些CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13系統相比于CRISPR/Cas9還具有尺寸更小便于AAV和質粒遞送、PAM差異化序列、無需tracrRNA、編輯策略設計靈活等差異特性。
此外，CRISPR/Cas13基因編輯工具靶向RNA，提供了RNA水平的一種編輯手段，具有高度的靶向特異性，在非遺傳性疾病的藥物開發方面具有巨大的商業價值。這與CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12作用在DNA水平的成藥策略是不一樣的。CRISPR/Cas13其中的RNA敲降成藥策略方面與化學修飾小核酸的作用類似，后者是基于化學合成路線的原理。業內人士認為，CRISPR/Cas13RNA編輯工具的應用，在未來也將會找到獨具優勢的適應癥或者應用場景。
總體來說，Cas家族蛋白的真正應用，一般需要挖掘發現和序列優化：
首先，要在TB級的豐富數據庫中，通過AI、生物信息學、蛋白質結構學等綜合分析，找尋潛在功能性蛋白。
其次，要在野生型的蛋白基礎上進行各種序列的優化，改造和修飾。對于已經發現的CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13等家族，野生型蛋白都有一定的局限性，科學家也是對它們的序列進行優化和改造，來提高它們的編輯效率、PAM序列識別區域、特異性以及降低脫靶效應、優化編輯工具的大小等。
04 投資機構還需被“教育”
底層技術和產品管線同等重要
通過上述篇幅，我們能夠看出基因編輯工具就像是細胞與基因治療行業的奠基石，只有不斷的開發和優化基因編輯工具，細胞與基因治療產業才能走得更遠。但是我們也能發現一個現象，國內大部分企業針對基因編輯工具的開發和優化都十分“低調”，從不宣傳。造成這一現象的原因有三：
首先，每家企業都有自己的形象定位和宣傳的偏向性。對于宣傳基因編輯工具，還是細胞與基因治療管線，企業選擇自由。
其次，大部分該領域的企業覆蓋到產業端時，大家可能更傾向于將顯性的藥品本身的里程碑進展對外進行宣傳，從而增強企業的品牌影響力和對投資人的吸引力。
再而，要想做到真正的底層創新，并不是一件易事。例如針對CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13的開發，目前一般都是先篩選野生型Cas12/Cas13蛋白，但野生型蛋白一般難以兼顧用作藥物治療時的安全性、有效性、免疫原性、脫靶等，而需要做一定的工程化改造。能做到這類工作的國內企業少之又少。尤其是大部分初創企業，在資金和人才的雙重匱乏下，沒有進行底層創新的實力和時間。大多數企業會選擇在推進管線研發的過程中，順便做一些技術創新。
未來，新型的CAS蛋白或者是基于現有CAS蛋白的開發和優化，大體會朝著活性更高、脫靶風險更小、PAM識別范圍更廣、尺寸更小、分子組合應用創新等方向發展。
另一方面，在歐美生物醫藥行業，初創企業可以輕松憑借一個新的蛋白或一項新的技術，得到投資人的認可，從而獲得不菲的融資。從國內投資現狀來講，大部分投資人則更看重藥物本身的進展。在這一點上，國內的投資人還需要被持續教育：底層技術是公司未來發展的基石。
隨著行業的不斷向前，投資人們也在不斷接受新知識的洗禮。越來越多的在關注產品時，也會特別關注一些具有真正含金量技術的藥物研發企業。雖然不同的投資人判斷產品和技術的權重比例不同，但是這兩者之間本身就是相輔相成的關系。產品是成功技術的體現和放大，技術是產品研發的根基和后盾。